1. 稱量與稀釋：準確稱取25g（果蔬、水產(chǎn)品除貝類取50g）樣品，加入裝有100mL無菌0.1%蛋白胨水的帶濾網(wǎng)均質(zhì)袋中。

2. 均質(zhì)與過濾：使用拍擊式均質(zhì)器以規(guī)定力度均質(zhì)1-2分鐘，使樣品充分破碎、菌體釋放。隨后通過均質(zhì)袋自帶的濾網(wǎng)，將勻漿過濾至無菌離心管中，以去除大顆粒雜質(zhì)。

3. 離心富集：將濾液在4℃、12000g條件下離心15分鐘，棄去上清。此步驟可重復以充分富集目標菌體。

4. 重懸：用1mL無菌生理鹽水重懸沉淀，取全部懸浮液加入9mL彎曲菌增菌液中。

5. 增菌培養(yǎng)：將彎曲菌增菌液置于微需氧環(huán)境（85%N?, 10%CO?, 5%O?）中，42℃±1℃培養(yǎng)24h±2h。

   
   

關(guān)鍵控制點：

1. 精準定量稀釋： 樣品稱量及稀釋步驟的準確性直接影響后續(xù)增菌效果的可比性。推薦使用HD-DT系列自動樣品稀釋儀，該儀器通過精密天平自動稱量樣品，根據(jù)稱量結(jié)果和設(shè)置的稀釋比例，自動計算需要加的稀釋液，并控制精密泵加裝稀釋液，操作簡便，為后續(xù)增菌環(huán)節(jié)的均一性與可靠性奠定堅實基礎(chǔ)。

2. 均質(zhì)效率：均質(zhì)的充分與否直接決定菌體釋放率。推薦使用HD-H15拍打式均質(zhì)器，其拍擊間距、速度與時間可調(diào)，能針對不同食品基質(zhì)的特性進行優(yōu)化，確保均質(zhì)效果均一、高效。

3. 低溫離心：全程需在4℃環(huán)境下操作，保持彎曲菌的活性。

4. 無菌操作：過濾、轉(zhuǎn)移、重懸等步驟需嚴格無菌，防止交叉污染。

5. 微需氧環(huán)境精準控制：這是成功分離的關(guān)鍵。彎曲菌對氧氣敏感，而傳統(tǒng)的微需氧培養(yǎng)方法（如產(chǎn)氣袋、手套箱）普遍存在“操作繁瑣"、“氣體消耗大"、“環(huán)境難控"等問題。

   推薦采用HD-AN系列智能厭氧/微需氧培養(yǎng)系統(tǒng)，可一鍵自動抽排置換氣體，快速、精確地建立并維持5%氧氣濃度的環(huán)境，且配套培養(yǎng)罐可脫機使用，銜接培養(yǎng)與轉(zhuǎn)運流程。

HD-AN系列 智能厭氧/微需氧培養(yǎng)系統(tǒng)

   濾膜培養(yǎng)法，是新標準為提升空腸彎曲菌和結(jié)腸彎曲菌分離選擇性而引入的重要技術(shù)。其原理是利用0.45μm孔徑的濾膜，允許體型纖細、具有特殊螺旋運動的彎曲菌通過，而大部分雜菌則被截留，從而顯著提高目標菌的檢出率。

（1）前期準備

1. 用無菌鑷子將0.45μm無菌濾膜平整貼附于哥倫比亞血瓊脂平板和卡瑪麗血瓊脂平板中央，確保無氣泡。

（2）過濾操作

1. 取300μL經(jīng)42℃微需氧增菌24小時后的培養(yǎng)物，分4-6小滴滴加在濾膜上（勿超出濾膜邊緣）。

2. 在室溫下靜置45-60分鐘（微需氧或普通氣體環(huán)境），讓菌液充分滲透，期間切勿移動濾膜。

3. 用無菌鑷子小心移除濾膜。

（3）培養(yǎng)與觀察

1. 將平板立即翻轉(zhuǎn)，置于微需氧環(huán)境中，42℃±1℃培養(yǎng)24-48小時。

2. 培養(yǎng)24-48小時后，在兩種平板上尋找分散凸起、邊緣整齊發(fā)亮的可疑菌落（卡瑪麗平板上呈淡灰色，表面濕潤有金屬光澤；哥倫比亞平板上呈灰白色，濕潤有光澤）。

關(guān)鍵提示：

1. 必須保證足夠的液體滲透時間，時間不足可能導致細菌無法穿過濾膜。

2. 操作全程需嚴格無菌，微需氧環(huán)境的快速建立與穩(wěn)定維持是方法成功的關(guān)鍵，直接影響目標菌的復蘇與生長。

（1）可疑菌落純培養(yǎng)

1. 從濾膜法培養(yǎng)后的平板上，挑取至少5個（不足5個則全挑）典型可疑菌落，分別劃線接種至新的哥倫比亞血瓊脂平板，以獲得單菌落。

2. 置于微需氧環(huán)境中，42℃±1℃培養(yǎng)24-48小時。

（2）革蘭氏染色與鏡檢（形態(tài)觀察）

1. 挑取純培養(yǎng)后的單個菌落，嚴格按照標準流程進行革蘭氏染色，隨后油鏡觀察。

2. 判定：彎曲菌屬應為革蘭氏陰性桿菌，菌體形態(tài)典型者可見S形、螺旋形或海鷗展翅狀（部分菌株形態(tài)可能不典型）。

（3）氧化酶試驗

1. 用非鐵質(zhì)接種環(huán)（如鉑金環(huán)或一次性塑料環(huán)）挑取菌落，涂抹于被氧化酶試劑浸濕的濾紙上。

2. 判定：在10秒內(nèi)，涂抹點出現(xiàn)紫紅色、紫羅蘭色或深藍色，即為陽性。

（4）有氧條件下25℃生長試驗

1. 挑取菌落接種至哥倫比亞血瓊脂平板，置于普通有氧環(huán)境中，25℃±1℃培養(yǎng)48小時。

2. 判定：培養(yǎng)后無菌生長為符合彎曲菌屬特性（陽性結(jié)果）。

關(guān)鍵控制點：

1. 確保獲得純培養(yǎng)物，這是所有后續(xù)鑒定試驗準確的前提。

2. 染色結(jié)果的清晰、準確至關(guān)重要，是排除其他革蘭氏陽性雜菌干擾的第一步。

   推薦使用HD-GM100全自動革蘭氏染色儀，提升鑒定流程的標準化、安全性與效率。

• 標準化染色流程：儀器自動完成涂片、固定、染色、脫色、復染及干燥全流程，確保每張玻片染色效果高度一致，消除人工操作差異。

• 高效批量處理：支持連續(xù)批量處理樣本，一鍵啟動即可自動運行，顯著提升實驗室檢測通量，解放人力。

• 安全與質(zhì)量保障：封閉式操作有效減少試劑暴露和交叉污染風險；標準化輸出確保染色質(zhì)量穩(wěn)定，菌體形態(tài)清晰易辨，結(jié)果可追溯。

3. 氧化酶試驗中必須使用非鐵質(zhì)工具，避免鐵離子導致假陽性；嚴格計時觀察。

   在獲得彎曲菌屬的可疑菌落后，標準中允許使用微生物生化鑒定系統(tǒng)替代傳統(tǒng)的*酶、馬尿酸鈉水解、吲哚乙酸酯水解試驗等單項試驗，進行種水平的鑒定與確認。

1. 菌懸液制備：挑取純培養(yǎng)的可疑菌落，配制為符合系統(tǒng)要求濁度的菌懸液。

2. 試劑板接種：將菌懸液接種至專用生化鑒定試劑板（如革蘭氏陰性菌鑒定板或特定彎曲菌鑒定板）的微孔中。

3. 培養(yǎng)與讀數(shù)：將試劑板放入微生物生化鑒定系統(tǒng)配套的孵育倉/判讀器中，在適宜條件下培養(yǎng)一定時間（通常4-24小時）。

4. 自動分析與報告：系統(tǒng)通過自動感光比色及矩陣概率算法，讀取生化反應結(jié)果，并與內(nèi)置數(shù)據(jù)庫比對，自動給出菌種鑒定結(jié)果及置信度。

   推薦使用HD-MT系列細菌麥氏濁度儀用于制備標準麥氏濁度的菌懸液，為細菌鑒定提供樣品質(zhì)量保證。

HD-MT系列 細菌麥氏濁度儀

   此外，HD-MA系列自動微生物生化鑒定及藥敏系統(tǒng)配套的專用試劑板與數(shù)據(jù)庫，可準確鑒定空腸彎曲菌、結(jié)腸彎曲菌及其它常見微生物，極大提升了鑒定效率與標準化水平。

HD-MA系列自動微生物生化鑒定及藥敏系統(tǒng)

1. 標準化與高通量：此方法將多項繁瑣的手工試驗集成于一塊試劑板，實現(xiàn)了標準化和高通量操作。

2. 結(jié)果客觀：避免了人工判讀的主觀誤差，結(jié)果更客觀、可追溯。

   新標準在傳統(tǒng)生化鑒定基礎(chǔ)上，明確新增了實時熒光PCR與MALDI-TOF MS作為種水平鑒定（區(qū)分空腸彎曲菌與結(jié)腸彎曲菌）的確證方法，為實驗室提供了更高效、更精準的鑒定路徑。

   PCR方法可在數(shù)小時內(nèi)獲得高特異性結(jié)果，是快速篩查與確證的理想選擇。

1. DNA模板制備（熱裂解法）：挑取1-3個純培養(yǎng)菌落，懸浮于500μL無菌去離子水中，100℃水浴/金屬浴加熱10分鐘，冰浴或室溫短暫冷卻后，8000-13000g高速離心10min取上清即為DNA模板。

2. PCR反應體系配制：嚴格按標準配制反應體系，需包含針對cj0415基因（空腸彎曲菌）和zupT基因（結(jié)腸彎曲菌）的特異性引物與探針。

3. 上機擴增：將反應管置于實時熒光PCR儀中，運行標準程序（94℃預變性30秒；隨后94℃變性5秒、60℃退火延伸30秒，循環(huán)40次）。

4. 結(jié)果判讀：根據(jù)FAM和VIC通道的Ct值及擴增曲線，判斷是否檢出目標基因。

關(guān)鍵控制點：

1. 防污染：PCR實驗需在獨立分區(qū)進行，嚴格防止氣溶膠污染。

2. 對照設(shè)置：必須同時設(shè)立陽性對照、陰性對照和空白對照，確保結(jié)果有效。

   彎曲菌屬內(nèi)不同菌種的鑒定對于彎曲菌感染的防控和治療具有重要意義，針對不同菌種的PCR技術(shù)，手動配制反應體系繁瑣且易出錯。因此迫切需要一種能夠快速、準確、廣譜鑒定彎曲菌屬內(nèi)菌種的方法。

   推薦使用彎曲菌六重核酸檢測試劑盒（探針法）等商品化試劑盒。該方案將多重PCR檢測與內(nèi)標監(jiān)控集成于單管單次反應中，不僅符合國標引物探針序列要求，還簡化了操作，極大地提升了檢測通量與效率。

   彎曲菌六重核酸檢測試劑盒（探針法）可用于包括彎曲菌屬、空腸彎曲菌、結(jié)腸彎曲菌、紅嘴鴨（海鷗）彎曲菌、烏普薩拉彎曲菌以及胎兒彎曲菌的檢測及鑒定。

  本試劑盒包含彎曲菌六重檢測液A、彎曲菌六重檢測液B、彎曲菌六重陽性對照、陰性對照，采用多重實時熒光PCR技術(shù)，對同一樣本采用A、B兩個三重熒光PCR反應檢測、鑒定是否含有重要的食源性彎曲菌屬內(nèi)菌種，同時確定菌種是空腸彎曲菌、結(jié)腸彎曲菌、紅嘴鴨（海鷗）彎曲菌、烏普薩拉彎曲菌或者胎兒彎曲菌。

   MALDI-TOF MS通過分析微生物獨特的蛋白質(zhì)指紋圖譜進行鑒定，是新國標推薦的另一項前沿技術(shù)，能將鑒定時間縮短至分鐘級。

1. 靶板樣本制備：

• 直接涂抹法：將少量純培養(yǎng)菌落直接均勻涂抹于質(zhì)譜靶板點樣位。

• 甲酸提取法（推薦）：在菌落涂抹處加1μL 70%甲酸，干燥后再覆蓋1μL基質(zhì)溶液（如HCCA）。

2. 上機檢測：將靶板放入質(zhì)譜儀，儀器自動進行激光轟擊、數(shù)據(jù)采集。

3. 數(shù)據(jù)庫比對與鑒定：系統(tǒng)將采集的蛋白譜圖與內(nèi)置數(shù)據(jù)庫進行比對，給出最可能的菌種鑒定結(jié)果及置信度評分。

   
   

關(guān)鍵控制點：

1. 樣本前處理一致性：前處理方法是影響譜圖質(zhì)量的關(guān)鍵，需標準化。

2. 數(shù)據(jù)庫完整性：數(shù)據(jù)庫是否涵蓋目標菌種直接影響鑒定能力。

HD-M-Discover系列

微生物質(zhì)譜快速鑒定分析系統(tǒng)

   為滿足新國標對MALDI-TOF MS方法的應用要求，HD-M-Discover系列微生物質(zhì)譜快速鑒定分析系統(tǒng)提供了強大的技術(shù)支撐：

1.  優(yōu)異性能，穩(wěn)定可靠

   系統(tǒng)搭載高性能固體激光器與新一代控制芯片，確保激光發(fā)射穩(wěn)定、靶板定位精準，保障儀器在各類實驗室環(huán)境下長期穩(wěn)定運行。

2.  精準鑒定，技術(shù)先進

   依托“基因+蛋白+AI"三重技術(shù)，系統(tǒng)內(nèi)置全新升級的菌種質(zhì)譜圖數(shù)據(jù)庫及智能算法，對空腸彎曲菌、結(jié)腸彎曲菌等食源性致病菌的鑒定準確率顯著提升，并能有效識別罕見菌。

3.  極速高效，流程智能

• 高速檢測：單樣本檢測可低至6秒，整板（96樣本）最快10分鐘即可完成全自動鑒定，實現(xiàn)從“小時級"到“分鐘級"的效率飛躍。

• 全流程自動化：實現(xiàn)從樣本上機到結(jié)果輸出的一鍵式操作。硬件狀態(tài)實時監(jiān)控與自動報警，最大限度減少人為誤差與操作門檻。

• 數(shù)據(jù)深度挖掘：除快速鑒定外，系統(tǒng)支持主成分分析、聚類分析等功能，為菌株同源性分析與疫情溯源提供強大數(shù)據(jù)支持。

青島中創(chuàng)匯科試劑

彎曲菌系列產(chǎn)品一覽